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 【背景介绍】

糖尿病患者伤口愈合不良导致世界范围内高发病率和高死亡率。受伤后恢复皮肤的完整性，体内稳态以及保护功能对人类生存至关重要。除细菌感染外，敌对的高血糖和氧化微环境进一步阻碍了糖尿病皮肤伤口的恢复。在糖尿病条件下，包括中性粒(白)细胞在内的免疫细胞会产生更多的活性氧（ROS），导致糖尿病器官受损，形成瘢痕时间延长或伤口无法愈合。此外，高血糖症可引起血管收缩并抑制血管新生，这是通过阻断氧气供应而阻碍了愈合过程。因此，迫切需要开发一种有效的策略以消除ROS和连续供应O2来有效调节血糖。一种新型的二氧化锰（MnO2）纳米片（即:纳米酶）已被证明能催化最丰富的内源性ROS（H2O2）分解成O2，这代表了缓解氧化压力和缺氧的有希望的候选物。胰岛素是治疗1型和2型晚期糖尿病患者以维持正常血糖的必需激素。因此，将胰岛素递送和MnO2纳米酶整合到生产中，将有利于促进皮肤伤口的愈合。

【科研摘要】

糖尿病伤口的愈合仍然是一项严峻的挑战,因为其易受多重耐药性（MDR）细菌感染以及高血糖和氧化性伤口微环境的影响。近日，西安工业大学长江学者张秋禹教授团队开发了可注射自愈粘附性水凝胶（FEMI）以同时克服这些障碍（图1）。

图1. FEMI水凝胶用于MDR细菌感染的糖尿病伤口愈合示意图。

FEMI水凝胶是通过ε-聚赖氨酸（EPL）涂覆的MnO2纳米片（EM）和负载胰岛素的自组装Pluronic F127醛（FCHO）胶束之间基于席夫碱（Schiff-based）反应制备的。通过EPL和MnO2纳米片之类的“纳米刀”的协同组合，FEMI水凝胶对MDR细菌表现出了极好的抗菌能力。MnO2纳米酶通过将内生的H2O2分解为O2，从而重塑了氧化伤口微环境。同时，pH/氧化还原双响应FEMI水凝胶实现了胰岛素的持续时空控制释放，以调节血糖。作者研发的FEMI水凝胶证明了体内感染了MDR细菌的糖尿病伤口愈合加速，并且代表了一种用于治愈由糖尿病引起的广泛组织损伤的通用策略。该研究以题为“Nanoenzyme-Reinforced Injectable Hydrogel for Healing Diabetic Wounds Infected with Multi-Drug Resistant Bacteria”的论文发表在6月《Nano Letters》上。

【图文探讨】

1. pH和氧化还原响应的FEM水凝胶的合成与表征

从水钠锰矿型的MnO2前体剥离二维各向异性MnO2纳米片。通过透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）表征了地形特征。详细地，测得MnO2纳米片的尺寸为约330.86 nm，而厚度为约6.40 nm（图2a）。EPL通过简便的静电组件涂覆在MnO2纳米片的表面上，这可以通过zeta电位测量来确定（图2b）。芳香环在7.86和7.06 ppm处出现新的共振信号和醛基（-CHO）为9.90 ppm，表明形成了FCHO（图2c）。此外，扫描电子显微镜（SEM）和TEM图像显示了平均直径为1.15μm的自组装FCHO胶束。还进行了傅立叶变换红外（FTIR）（图2d）。在1687 cm-1处没有醛带，在1662 cm-1处没有新峰，表明FEMI水凝胶是通过EM和FCHO之间Schiff-based的反应成功形成的。此外，通过SEM分析进行了FEMI水凝胶的形态学特征（图2e）。进一步进行了X射线衍射（XRD）光谱分析，确定了水钠锰矿型MnO2纳米片的典型峰，表明MnO2纳米片已成功整合到FEMI水凝胶中。FEMI的元素（例如C，O和Mn）均在能量色散光谱仪（EDS）映射图中进行了说明（图2f，g）。FEM水凝胶由于存在FCHO而表现出独特的热敏性，临界的溶胶-凝胶转变温度从15.5℃降低到11℃，并且通过增加EM从0.05％到0.2％（FEM-1 0.05%,FEM-2 0.10%,FEM-3 0.15%,FEM-4 0.20%），机械性能急剧提高（图2h）。经过三次循环应变后，储能模量(G')和损耗模量(G'')在低应变（1％）下快速恢复，显示出FEM水凝胶具有出色的自愈能力（图2i）。此外，FEM水凝胶对猪皮肤的定量粘合强度可以达到1.58 kPa，远高于纯皮肤(636.6 Pa)，进一步证明了其高粘合性。特别是，FEM-4水凝胶的粘度从368.5急剧下降至约7.7 Pa·s，剪切速率从0.1变为100 1/s。

图2.（a）MnO2纳米片TEM图像。（b）在pH 7.4下测得的EPL，MnO2纳米片，EM纳米片的Zeta电位。（c）FCHO的1H NMR光谱。（d）分别为F127，F127-SO3，FCHO，MnO2纳米片（NS），EPL，EM和FEMI的FTIR光谱。（e）独特3D多孔结构的FEMI水凝胶SEM图像。（f）FEMI水凝胶放大SEM图像和EDS元素图。（g）EDS验证FEMI水凝胶中Mn离子含量。（h）FEM-4水凝胶的G’和G’’随温度从10到38°C。插图：FEM-4水凝胶的溶胶-凝胶转变照片。（i）FEM-4水凝胶的机械性能通过在37°C下在1％和1000％之间的三倍剪切应变循环期间测试G'和G'来评估。（j）通过剪脱试验评价FEM水凝胶对皮肤组织的粘合强度。（k）剪切速率为0.1至100 1/s的FEM水凝胶的粘度。插图：FEM水凝胶可注射性的照片。

2. 减轻氧化应激来增强细胞的存活增殖。

作者将MnO2纳米片作为纳米酶掺入FEM水凝胶中，以发挥ROS清除和O2补充剂的双重作用（图3a）。观察到清晰的MnO2纳米片的浓度依赖性H2O2分解和O2产生（图3b-d）。与H2O2对照组相比，与FEM-4水凝胶共同孵育的成纤维细胞显示出显着更低的绿色荧光（4.34倍），这表明FEM水凝胶可以有效减轻细胞内的氧化应激（图3e，g）。然后，还通过O2水平指示剂[Ru(dpp)3Cl2]评估了细胞内O2的升高，证实了明显的MnO纳米酶含量依赖性O2生成，因为[Ru(dpp)3Cl2]的荧光被显着淬灭（图3f，h）。研究了FEMI水凝胶的体外胰岛素释放行为（图3i）。 最后，还进行了成纤维细胞的体外增殖（图3j，k）。与FEM水凝胶一起培养的成纤维细胞在5天的培养期内显示出持续增殖，与对照组相比没有显着差异。

图3.（a）减轻FEM水凝胶中MnO2纳米片催化氧化应激并生成O2的示意图。（b）通过测量H2O2指示剂溶液的UV-Vis吸收光谱评估MnO2纳米片对H2O2的剂量依赖性消除。（c）应用不同MnO2纳米片含量的水凝胶后，对溶液中残留的H2O2进行定量分析。（d）用商业氧气计记录了大量氧气的产生。（e）在不同处理后通过ROS探针（DCFH-DA）监测L929细胞中氧化应激的减轻。（f）通过O2探针验证了细胞内O2生成测定。（g-h）分别通过计数L929细胞的荧光强度来分析细胞内ROS消耗和O2产生的定量研究。（i）pH和氧化还原双重反应性胰岛素释放动力学。（j-k）通过活/死染色进行成纤维细胞的体外增殖。

3. FEM水凝胶的抗菌性能和止血能力。

作者在体外对FEM水凝胶的抗菌性能进行了综合评估。这里使用金黄色葡萄球菌，MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性）和大肠杆菌（革兰氏阴性）作为模型细菌（图4a，b）。期望地，与PBS和抗生素氨苄西林相比，FEM水凝胶对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和MRSA表现出优异的抗菌能力。当它们附着在MnO2纳米片表面时，微生物的形态会受到影响，并且在与EM膜和FEM水凝胶孵育后变得更加粗糙和受损（图4c）。使用小鼠出血性肝模型评估了FEM水凝胶的止血能力（图4d）, 因为出色的抗菌能力和出色的生物相容性，作者决定将FEM-4水凝胶用于随后的体内止血和伤口愈合研究。尽管FCHO水凝胶和商品merocel（止血海绵）组的出血量在一定程度上有所降低（分别为3.5倍和4.2倍），但与空白对照组相比， FEM治疗组的失血量明显减少（21.2倍）（图 4e，f）。

图4.（a-c）具有不同EM含量的FEM水凝胶的抗菌活性分析。（d）说明在糖尿病小鼠的肝出血模型中FEM水凝胶的止血能力的示意图。（e）经对照（未治疗），merocele，FCHO和FEM水凝胶治疗的受损肝脏的总失血量。（f）在0、5、15、30、60 s的某些时间经过上述处理的肝脏的代表性照片。

4.FEMI水凝胶通过构建微环境促进糖尿病伤口愈合。

作者使用MRSA感染的糖尿病创伤模型进一步检查了FEMI水凝胶的细菌抑制和伤口愈合能力（图5a）同时，在持续的伤口愈合实验中，用FEM和FEMI处理的小鼠的伤口显示出明显加速的伤口闭合。更具体地说，FEM组和FEMI组在第7天分别导致伤口闭合71.9％和78.2％，明显高于PBS对照组（39.9％），AM组（44.1％）和FCHO组 （58.1％）。 值得注意的是，在第14天，装有FEMI水凝胶的伤口愈合最好（剩余11.70％），基本上被新形成的皮肤覆盖（图5b-d）。作者在实验期间进一步监测了血糖和胰岛素水平。 血浆胰岛素水平从21μU/ml增加到259μU/ml，与血糖水平升高有关，然后在第5天逐渐降低至38μU/ml（图5e）。

图5.（a）示意图论述了FEMI水凝胶的抗菌行为和加速伤口闭合性能的操作过程时间轴。（b）用对照，抗生素氨苄青霉素，FCHO，FEM和FEMI水凝胶治疗小鼠伤口愈合过程的图像。（c）每种治疗在14天内伤口床闭合的痕迹。（d）五组在不同时间点的体内伤口闭合率。（e）五个糖尿病小鼠组在不同时间点的血糖变化。（f）在不同处理之后，通过ROS探针（二氢乙啶，DHE）监测伤口区域中的ROS水平。（g）氧化DHE荧光强度的直方图显示FEM和FEMI水凝胶组中有效消耗了ROS。（h）在第3、7和14天五种不同治疗方法的伤口再生的组织形态学评估。（i）在第7天，不同组的表皮厚度。（j）在第7和14天的再生血管。（k）在第14天，不同组的毛囊。

接着，作者进行了全面的研究，以揭示潜在的机制并评估伤口的愈合进度。 首先，作为糖尿病中典型的炎症因子，体内的细胞内ROS水平通过二氢乙啶（DHE）染色指示（图5f，g）。 正如预期的那样，由于对FEM水凝胶进行敷料，我们观察到红色荧光显着减少，表明其出色的抗氧化性能。 更令人惊讶的是，胰岛素包封组（FEMI）显示出甚至更低的ROS产生，这可能归因于葡萄糖水平的降低。 还评估了阻碍组织恢复的典型炎性细胞因子白介素-6（IL-6）。 与其他对照组相比，FEMI组表现出显着的下调，表明水凝胶缓解了炎症反应。伤口再上皮形成和肉芽组织形成已被鉴定为评估伤口愈合过程的典型指标。 随着修复过程的进展，在第7天，FEMI治疗组形成了多层，完全连接且较厚的（182.2 um）上皮结构，非常类似于完整皮肤的健康表皮（图5h，i）。作者推测葡萄糖水平降低可以促进血管形成。H＆E染色图像进一步证实实验组中形成了更多的血管，这提供了促进伤口愈合的刺激因素（图5j）。

【观点总结】

总之，作者设计并验证了一种可有效促进MDR细菌感染的糖尿病伤口愈合的可注射，粘合，自愈，抗氧化和抗菌的FEMI水凝胶。通过引入2D EM纳米填料与聚合物基质相互作用，制备了具有快速凝胶行为和稳定流变性能的水凝胶。通过将带正电的EPL和“纳米刀”（如MnO2纳米片）协同结合， FEMI水凝胶在体外和体内对MDR细菌均显示出非凡的抗菌能力。此外，FEMI水凝胶在小鼠肝损伤模型中也表现出出色的止血作用。在糖尿病伤口独特的酸性和氧化性微环境下，证明了FEMI水凝胶通过将内源性H2O2转化为O2并同时释放胰岛素来调节血糖水平，从而有效缓解了氧化应激。

FEMI水凝胶将MDR细菌的消灭，高血糖症的缓解，氧化应激的改善，持续的O2生成整合到一个平台中，从而协同地减少了炎症反应，刺激了血管生成，加速了细胞增殖，促进了肉芽组织的形成和ECM沉积，并显示了加速糖尿病发展的巨大潜力体内皮肤重建。据悉，这是首次通过全面构建有益的皮肤微环境构建多功能水凝胶以促进MDR感染的糖尿病伤口愈合的研究。总的来说， FEMI水凝胶表明了一种广泛的策略，可以再生受到细菌入侵和高氧化性疾病微环境影响的糖尿病中广泛的受损组织。

【通讯简介】

张秋禹，“长江学者”特聘教授，博士生导师，西北工业大学应用化学研究所所长，中国化学会会员，陕西省化学会理事，中国材料研究学会高分子材料与工程分会委员，陕西省环境学会理事，中国颗粒学会理事等。《高分子材料》、《化学工程》、《粘接》等期刊编委。她目前主要研究领域包括1.运用点击化学控制高性能聚合物的制备，微/纳米响应性多孔有/无机杂化纳米及功能复合材料，发表了超过200篇SCI在国际期刊上。培养硕博士超过15人。